蛍光寿命イメージング (FLIM)
inVia™ コンフォーカルラマンマイクロスコープでの相関 FLIM/ラマン分光
inVia™ コンフォーカルラマンマイクロスコープでは、蛍光寿命イメージング (FLIM) も行えるため、蛍光寿命イメージをシームレスに測定したり、分析したり、ラマンデータと重ね合わせたりすることができます。
FLIM とは
光が蛍光色素分子にあたると、蛍光寿命が測定されます。蛍光寿命とは、蛍光色素分子が光子を放出して基底状態に戻る前の励起電子状態にある時間を指します。この寿命の測定に基づくイメージングが蛍光寿命イメージング (FLIM) と呼ばれます。
蛍光の減衰の寿命は分子環境とそして分子配座に生じる変化からの影響を受けます。FLIM では幅広い要素を明らかにできます。
- pH/イオン/酸素の濃度
- 分子結合
- エネルギー受容体の近接
FLIM には、蛍光色素分子の濃度に影響されない、内部自己参照型の測定であるため装置構成を加味するためのキャリブレーションを行う必要がない、といった強度ベースの測定にないメリットがあります。
FLIM は細胞生物学の研究に特に有効で、環境の検出、分子間相互作用のモニタリング、がんの診断、生細胞のイメージングそして蛍光色素分子の同定にも活用できます。
FLIM とラマンを相関させるメリット
相関的な FLIM/ラマン分光は、生体細胞や組織片のラベルフリーイメージングを補完する手法です。FLIM イメージからは分子間相互作用がわかり、また取得時間もラマンイメージに比べて 10 分の 1 以下で済むのも特徴です。ラマンイメージングで化学特性や構造情報を検出する対象領域を見極めるための理想的な技術と言えます。
レニショーのソリューション
レニショーは Becker & Hickl 社と協力し、時間相関単一光子計数法 (TCSPC) FLIM/ラマンマイクロスコープを生産しています。TCSPC FLIM では入射光がサンプルに当たってから反射した光が検出器に当たるまでの時間を測定します。光子の放出/蛍光の励起には 405nm パルスレーザー (パルス幅 <40ps) が使用されます (他のレーザー波長を使用することもできます)。放出された蛍光が単一光子アバランシェダイオード (SPAD) 検出器によって検出 (タイミング分解能 <40ps) されます。
この TCSPC をサンプルの複数ポイントで行うことで FLIM イメージが生成されます。レニショーの FLIM/ラマンシステムでは、ラマンマッピングと FLIM の両方を同じ MS30 ステージで行うため、共通の座標を基準にしてデータをピクセル単位で相関させることができます。
FLIM データの分析用に、Becker & Hickl 社製 TCSPC FLIM ソフトウェアと分析モデルが付属しています。このソフトウェアでは、寿命集団を区別するための専用フェーザ解析も可能です。蛍光寿命イメージとラマンイメージを、イメージの相関処理を行わずに直接重ね合わせることができます。
オンデマンドウェビナーのご案内
ラマン eBook: 相関ラマンイメージングの最新技術
ラマン分光はその活用分野や範囲が急速に拡大しています。ラマン分光を走査型電子顕微鏡 (SEM) や蛍光寿命イメージング (FLIM) と組み合わせ、さまざまな分野に応用する手法について紹介いたします。
- ラマン装置の進化とラマン技術のイノベーション
- SEM サンプル室内での in-situ ラマン測定と inLux SEM-ラマンインターフェースの役割
- 相関的な FLIM/ラマン分光 (植物の組織片や HeLa 細胞のイメージ例)
資料のダウンロード
